LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

EKSTRASI DNA

Oleh

Nurdiana Ismawati

 ( 1601070019 )

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

20017

26 November 2017

A.    JUDUL : EKSTRASI DNA

B.     TUJUAN

1.      Untuk mengetahui DNA yang terdapat pada tumbuhan kelapa

2.      Untuk mengetahui cara mengekstrasi DNA

3.      Untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi ekstrasi DNA

C.    DASAR TEORI

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia penting yang terdapat pada makhluk hidup. DNA mengandung informasi genetic makhluk hidup dari satu generasi ke generasi berikutnya. Keseluruhan dari DNA suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan interegen.         ( Suryo. 2004 ).

DNA murni bisa didapatkan dari suatu sel dalam tubuh makhluk hidup dengan suatu teknik yaitu isolasi DNA. Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya ( ekstrasi atau lisis ), bisanya dilakukan dengan cara menghomogenkan dan menambahkan buffer ekstrasi atau buffer lisis untuk mencegah kerusakan DNA ( Yuwono. 2008 ). Pada sel eukariotik dalam hal ini adalah sel tumbuhan kelapa, bagian terbesar DNA berada pada nucleus. Pada nucleus terdapat 90% keseluruhan DNA seluler. Sisa dari DNA berupa organel lain seperti mitokondria dan kloroplas, karena DNA terdapat dalam nucleus sehingga memerlukan adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Metode tersebut merupakan bagian dari isolasi. Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal signifikan dan mengharuskan penyalinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein yeng berlangsung dalam ruang yang berbeda yaitu dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod. 2007 ).

 Sampel yang digunakan untuk ekstrasi DNA tumbuhan dapat berasal dari berbagai sumber, seperti jaringan segar, jaringan yang dibekukan dengan nitrogen cair.Sampel untuk ekstraksi DNA tumbuhan dapat berasal dari berbagai sumber, seperti jaringan segar, jaringan yang dibekukan dengan nitrogen cair , jaringan yang dikeringkan dengan slika gel. Namun pada saat proses isolosi DNA dari tumbuhan terdapat kesulitan pada destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel.  Hal ini dikarenakan tumbuhan memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa tumbuhan kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat sehingga menghambat kerja dari enzim. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat diawali dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti, baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen yang dapat menyebabkan rusaknya membran sel (Agus dan Sjafarenan, 2013)

Prinsip kerja ekstrasi DNA

1.      Preparasi sel/

Jaringan yang diambil secepatnya diekstrasi. Penyimpanan jaringan pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan dalam parrafin blok sulit untuk diekstrasi

2.      Lisis membrane sel/ orgenalla

Senyawa yang digunakan untuk meliskan membrane yaitu phenol : senyawa yang sangat kuat melisiskan membrane, tetapi toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksis, digunakan sebagai pengganti phenol

3.      Denaturasi Senyawa organic

Untuk mendenaturasi protein yang ada digunakan senyawa kloroform : paling banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan proteinase K untuk denaturasi protein tetapi perlu inkubasi

4.      Periptasi DNA

Digunakan senyawa isopropanol atau ethanol absolut dan sodium asetat

5.      Pencucian/washing

Pencucian sisa senyawa menggunakan ethanol 70%

D.    ALAT DAN BAHAN

a.       Alat

1.   Timbangan

2.   Waterbath

3.   Tabung eppendorft volume 2 ml

4.   Mortar dan pestel

5.   Spatula

6.   Sentrifuge

7.   Micropipet

8.   Blue tip dan yellow tip

b.      Bahan

1.      CTAB buffer

2.      Nitrogen cair

3.      CIAA ( chloroform isoamyl alcohol 24 : 1 )

4.      Ethanol absolut

5.      7,5 ammonium acetate

6.      Ethanol 70 %

7.      TE buffer

E.     CARA KERJA

1.      Menyiapkan CTAB buffer sebanyak 2 x volume / berat sampel (1ml) dan memasukannya kedalam incubator atau waterbath yang sudah diseting suhunya di 65⁰ C

2.      Mengambil daun kelapa yang muda dan menimbangnya sebanyak 0,5 gr

3.      Memasukan daun kedalam mortar dan menambhkannya nitrogen cair kemudian menggerusnya sampai halus

4.      Memasukan serbuk daun tersebut menggunakan spatula kedalam tabung Eppendorf yang berisi CTAB buffer diatas

5.      Memvorteknya sebentar

6.      Menginkubasi sampel diwaterbath / inkubater selama 1 jam, setiap 15 menit sekali memvorteknya

7.      Mensentrifuge dengan kecepatan 11.000 rpm selama 20 menit

8.      Mengambil supernatant dan memindahkannya kedalam tabung Eppendorf tabung

9.      Menambahkan CIAA sebanyak ½  dari volume supernatant kemudian memnyaflicking sampai tercampur

10.  Mensentrifuge kembali dengan kecepatan 11.000rpm selama 20 menit

11.  Mengambil supernatant dan memasukan kedalam tube baru, lalu menambahkan 1 ml ethanol absolut dan 0,1 ml 7,5 M ammonium accetat dan memflucking kembali sampai tercampur

12.  Memasukan sampel kedalam kulkas dan membiarkan selama24 jam

13.  Setelah 24 jam mensentrifuge sampel dengan kecepatan 13.000rpm selama 15 menit

14.  Membuang cairan dan mengunci kumpulan DNA yang tertinggal dengan ethanol 70 % (1ml) lalu mengeringkannya

15.  Menambhkan TE buffer sebanyak 300 mikroliter dan DNA siap untuk di elektoforensis.

F.     HASIL PENGAMATAN

G.    PEMBAHASAN

Berdasarkan  praktikum yang dilakukan sampel yang digunakan yaitu daun kelapa yang masih muda untuk menemukan DNA nya. Untuk mendapatkan DNA kelapa dibutuhkan beberapa bahan yaitu CTAB ( Cetyl trimethylammonium bromide) merupakan sejenis detergen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membrane sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat  keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstrasi. Dalam proses isolaso DNA tumbuhan, penambahan senyama preduksi seperti merchaptoetanol yang dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat ativitas radikal bebas yang dihasilkan oksidasi fenol terhadap asam nucleus. CIAA berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen polisakardia di dalam buffer ekstrasi yang mengkontaminasi larutan DNA . Pemberian etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitas.  TE buffer berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Nitrogen cair berfungsi untuk mengefisienkan lisisnya sel tanpa adanya perbedaan besar temepratur yang dapat merusak DNA.

Pada proses penggeruan daun kelapa agar menjadi serbuk  jangan sampai membuat DNA yang ada, rusak meskipun digerus dengan sangat keras oleh karena itu saat menggerus ditambahkan nitrogen cair.  pemanasan pertama pada waterbath bertujuan untuk mendegradasikan protein dan dinding sel. Sedangkan pada sentrifuge untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul besar yang akan berada dibawah tabung dan molekul ringan akan berada dipermukaan. Pada hasil sentrifuge akan Nampak dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatant pada bagian permukaan dan pellet pada bagian bawah. hal ini sesuai dengan hasil pengamatan dimana campuran yang ada dalam tabung Nampak terpisah menjadi dua fraksi.

Setelah dilakukan serangkaian tahap yang terakhir yaitu pemberian TE buffer sebanyak 300 microliter setelah 24 jam dimasukan ke dalam kulkas. Hasilnya akan Nampak warna putih melayang yang berada dalam tabung. Itu adalah DNA yang siap dilakukan elektroforensis.

H.    KESIMPULAN

1.      CTAB merupakan detergen yang berfungsi mendegradasikan dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membrane sel dan melarutkan DNA

2.      CIAA berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ekstrasi yang mengkontaminasi larutan DNA

3.      TE buffer berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkann dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak.

4.      Teknik sentrifuge bertujuan untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul, molekul besar akan berada di bawah tabung sedangkan molekul kecil berada di permukaan.

5.      Setelah dilakukan serangkaian prosedur kerja nampak  ada warna putih melayang dalam tabung maka terdapat  DNA

I.       DAFTAR PUSTAKA

Elrod, S. 2007. Genetika Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga

Suryo. 2004. Genetika Sastra 1. Yogyakarta : Universitas Gajah Mada

Yuwono, T.2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga

Tata Renita Idea. 2014.Ekstrasi DNA. https://tatarenjuly.wordpress.com/2014/11/27/ekstraksi-dna/. Diakses pada 26 November.2017

Uul Shovi Nurkamila, Made Pharmawati (2104). Ekstrasi DNA dari Herbarium Anggrek ( DNA Extraction from Orchid Herbarium Materilas ). Hlm 2

J.      LAMPIRAN

     

     LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

EKSTRASI DNA

Oleh

Nurdiana Ismawati

 ( 1601070019 )

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

20017

26 November 2017

A.    JUDUL : EKSTRASI DNA

B.     TUJUAN

1.      Untuk mengetahui DNA yang terdapat pada tumbuhan kelapa

2.      Untuk mengetahui cara mengekstrasi DNA

3.      Untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi ekstrasi DNA

C.    DASAR TEORI

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia penting yang terdapat pada makhluk hidup. DNA mengandung informasi genetic makhluk hidup dari satu generasi ke generasi berikutnya. Keseluruhan dari DNA suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan interegen.         ( Suryo. 2004 ).

DNA murni bisa didapatkan dari suatu sel dalam tubuh makhluk hidup dengan suatu teknik yaitu isolasi DNA. Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya ( ekstrasi atau lisis ), bisanya dilakukan dengan cara menghomogenkan dan menambahkan buffer ekstrasi atau buffer lisis untuk mencegah kerusakan DNA ( Yuwono. 2008 ). Pada sel eukariotik dalam hal ini adalah sel tumbuhan kelapa, bagian terbesar DNA berada pada nucleus. Pada nucleus terdapat 90% keseluruhan DNA seluler. Sisa dari DNA berupa organel lain seperti mitokondria dan kloroplas, karena DNA terdapat dalam nucleus sehingga memerlukan adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Metode tersebut merupakan bagian dari isolasi. Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal signifikan dan mengharuskan penyalinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein yeng berlangsung dalam ruang yang berbeda yaitu dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod. 2007 ).

 Sampel yang digunakan untuk ekstrasi DNA tumbuhan dapat berasal dari berbagai sumber, seperti jaringan segar, jaringan yang dibekukan dengan nitrogen cair.Sampel untuk ekstraksi DNA tumbuhan dapat berasal dari berbagai sumber, seperti jaringan segar, jaringan yang dibekukan dengan nitrogen cair , jaringan yang dikeringkan dengan slika gel. Namun pada saat proses isolosi DNA dari tumbuhan terdapat kesulitan pada destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel.  Hal ini dikarenakan tumbuhan memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa tumbuhan kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat sehingga menghambat kerja dari enzim. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat diawali dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti, baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen yang dapat menyebabkan rusaknya membran sel (Agus dan Sjafarenan, 2013)

Prinsip kerja ekstrasi DNA

1.      Preparasi sel/

Jaringan yang diambil secepatnya diekstrasi. Penyimpanan jaringan pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan dalam parrafin blok sulit untuk diekstrasi

2.      Lisis membrane sel/ orgenalla

Senyawa yang digunakan untuk meliskan membrane yaitu phenol : senyawa yang sangat kuat melisiskan membrane, tetapi toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksis, digunakan sebagai pengganti phenol

3.      Denaturasi Senyawa organic

Untuk mendenaturasi protein yang ada digunakan senyawa kloroform : paling banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan proteinase K untuk denaturasi protein tetapi perlu inkubasi

4.      Periptasi DNA

Digunakan senyawa isopropanol atau ethanol absolut dan sodium asetat

5.      Pencucian/washing

Pencucian sisa senyawa menggunakan ethanol 70%

D.    ALAT DAN BAHAN

a.       Alat

1.   Timbangan

2.   Waterbath

3.   Tabung eppendorft volume 2 ml

4.   Mortar dan pestel

5.   Spatula

6.   Sentrifuge

7.   Micropipet

8.   Blue tip dan yellow tip

b.      Bahan

1.      CTAB buffer

2.      Nitrogen cair

3.      CIAA ( chloroform isoamyl alcohol 24 : 1 )

4.      Ethanol absolut

5.      7,5 ammonium acetate

6.      Ethanol 70 %

7.      TE buffer

E.     CARA KERJA

1.      Menyiapkan CTAB buffer sebanyak 2 x volume / berat sampel (1ml) dan memasukannya kedalam incubator atau waterbath yang sudah diseting suhunya di 65⁰ C

2.      Mengambil daun kelapa yang muda dan menimbangnya sebanyak 0,5 gr

3.      Memasukan daun kedalam mortar dan menambhkannya nitrogen cair kemudian menggerusnya sampai halus

4.      Memasukan serbuk daun tersebut menggunakan spatula kedalam tabung Eppendorf yang berisi CTAB buffer diatas

5.      Memvorteknya sebentar

6.      Menginkubasi sampel diwaterbath / inkubater selama 1 jam, setiap 15 menit sekali memvorteknya

7.      Mensentrifuge dengan kecepatan 11.000 rpm selama 20 menit

8.      Mengambil supernatant dan memindahkannya kedalam tabung Eppendorf tabung

9.      Menambahkan CIAA sebanyak ½  dari volume supernatant kemudian memnyaflicking sampai tercampur

10.  Mensentrifuge kembali dengan kecepatan 11.000rpm selama 20 menit

11.  Mengambil supernatant dan memasukan kedalam tube baru, lalu menambahkan 1 ml ethanol absolut dan 0,1 ml 7,5 M ammonium accetat dan memflucking kembali sampai tercampur

12.  Memasukan sampel kedalam kulkas dan membiarkan selama24 jam

13.  Setelah 24 jam mensentrifuge sampel dengan kecepatan 13.000rpm selama 15 menit

14.  Membuang cairan dan mengunci kumpulan DNA yang tertinggal dengan ethanol 70 % (1ml) lalu mengeringkannya

15.  Menambhkan TE buffer sebanyak 300 mikroliter dan DNA siap untuk di elektoforensis.

F.     HASIL PENGAMATAN

G.    PEMBAHASAN

Berdasarkan  praktikum yang dilakukan sampel yang digunakan yaitu daun kelapa yang masih muda untuk menemukan DNA nya. Untuk mendapatkan DNA kelapa dibutuhkan beberapa bahan yaitu CTAB ( Cetyl trimethylammonium bromide) merupakan sejenis detergen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membrane sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat  keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstrasi. Dalam proses isolaso DNA tumbuhan, penambahan senyama preduksi seperti merchaptoetanol yang dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat ativitas radikal bebas yang dihasilkan oksidasi fenol terhadap asam nucleus. CIAA berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen polisakardia di dalam buffer ekstrasi yang mengkontaminasi larutan DNA . Pemberian etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitas.  TE buffer berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Nitrogen cair berfungsi untuk mengefisienkan lisisnya sel tanpa adanya perbedaan besar temepratur yang dapat merusak DNA.

Pada proses penggeruan daun kelapa agar menjadi serbuk  jangan sampai membuat DNA yang ada, rusak meskipun digerus dengan sangat keras oleh karena itu saat menggerus ditambahkan nitrogen cair.  pemanasan pertama pada waterbath bertujuan untuk mendegradasikan protein dan dinding sel. Sedangkan pada sentrifuge untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul besar yang akan berada dibawah tabung dan molekul ringan akan berada dipermukaan. Pada hasil sentrifuge akan Nampak dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatant pada bagian permukaan dan pellet pada bagian bawah. hal ini sesuai dengan hasil pengamatan dimana campuran yang ada dalam tabung Nampak terpisah menjadi dua fraksi.

Setelah dilakukan serangkaian tahap yang terakhir yaitu pemberian TE buffer sebanyak 300 microliter setelah 24 jam dimasukan ke dalam kulkas. Hasilnya akan Nampak warna putih melayang yang berada dalam tabung. Itu adalah DNA yang siap dilakukan elektroforensis.

H.    KESIMPULAN

1.      CTAB merupakan detergen yang berfungsi mendegradasikan dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membrane sel dan melarutkan DNA

2.      CIAA berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ekstrasi yang mengkontaminasi larutan DNA

3.      TE buffer berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkann dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak.

4.      Teknik sentrifuge bertujuan untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul, molekul besar akan berada di bawah tabung sedangkan molekul kecil berada di permukaan.

5.      Setelah dilakukan serangkaian prosedur kerja nampak  ada warna putih melayang dalam tabung maka terdapat  DNA

I.       DAFTAR PUSTAKA

Elrod, S. 2007. Genetika Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga

Suryo. 2004. Genetika Sastra 1. Yogyakarta : Universitas Gajah Mada

Yuwono, T.2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga

Tata Renita Idea. 2014.Ekstrasi DNA. https://tatarenjuly.wordpress.com/2014/11/27/ekstraksi-dna/. Diakses pada 26 November.2017

Uul Shovi Nurkamila, Made Pharmawati (2104). Ekstrasi DNA dari Herbarium Anggrek ( DNA Extraction from Orchid Herbarium Materilas ). Hlm 2

J.      LAMPIRAN