elektroforesis

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

ELEKTROFORESIS

Oleh :

Nurdiana Ismawati      ( 1601070019 )

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

2017

03 Desember 2017

A.    JUDUL  : ELEKTROFORESIS

B.     TUJUAN

1.      Untuk mengetahui cara melakukan elektroforesis

2.      Untuk mengetahui  DNA yang berasal dari sampel

3.      Untuk mengetahui macam – macam elektroforesis

C.    DASAR TEORI

Elektetroforesis berasa dari bahasa Yunani yang berarti transport/ perpindahan melalui partikel – partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara menganalisis kimiawi yang berdasarkan pada pergerakan molekul – molekul protein bermuatan didalam medan listrik . Pergerakan molekul dalam medan listrik dipenaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Jika dua molekul mempunyai bentuk dan masa yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektorda. Apabila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen protein tersebut akan berpindah. Dengan demikian elektroforesis  dapat digunakan untuk separasi makromolekul. (Magdaline. 2012) .

Dasar dari elektroferesis adalah pembentukan suatu ketidak homogenan atau gradasi kosentrasi sepanjang system. Koloid , protein enzim menunjukan mobilitas elektroforsis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat – zat spesifik juga . pemisahan dapat dilakukan bila senyawa – senya yang telah terpisah tidak secara spontan  bercampur kembali akibat srkulasi konektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. ( Martin. 1996 ).

Secara singkat elektroforesis adlah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirakan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromelkul misalnya DNA yang bermuatan negative ( Yuwono. 2005)

Dalam elektroforesis terdapat dua Teknik yang telah berkembang yaitu ektroforesis  horizontal dab vertical. Sedangkan berdasarkan jenisnya ada dua                     ( Lisdiyanti.1997 ) yaitu :

1.   Elektroforesis bebas : molekul atau partikel yang akan dipisahkan disebar diseluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersbut akan menyebabkan terbentuknya batas diantara dua larutan.

2.   Elektroforesis zona : merupakan jenis elektroforesis yang paling sering digunakan. Elektroforesis jenis ini menggunakan media penunjang seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau poliakrilamid.

D.    ALAT DAN BAHAN

a.       Alat

1.      Timbangan

2.      Microwave

3.      Erlenmeyer volume 100 ml

4.      Electrophoresis chamber

5.      Power supply

6.      Comb

7.      Tray

8.      Micropipit

9.      White tip dan yellow tip

10.  PCR tube

b.      Bahan

1.      TBE buffer

2.      Agarose

3.      Loading buffer

4.      DNA kelapa

5.      Ethidium bromide

E.     CARA KERJA

1.      Menimbang agarose kurang lebih 0,5 gr

2.      Mencampurkan agarose dengan TBE buffer sebanyak 50 ml (agarose 1 % ) dalam Erlenmeyer, menimbang dan mencatat beratnya. Kemudian memasak agarose menggunakan microwave setelah matang , menimbang lagi beratnya jika berkurang tambahkan TBE buffer sampai mencapai berat semula

3.      Memasukan agarose 1 % tadi dalam cetakan/ tray yang sudah dipasang comb menunggu sampai benar – benar padat.

4.      Setelah benar – benar padat, mengambil comb sehingga terbentuk sumuran

5.      Memasukan agarose beserta traynya kedalam elektroforesis chamber ( jangan terbalik posisinya, ujung agarose yang ada sumuranya harus berada didepan kutub negative), lalumenambahkan TEB buffer sampai batas yang sudah ditentukan

6.      Mengeluarkan sampel dari dalam kulkas kemudian memvortex sebentar.

7.      Mengambil loading buffer sebanyak 12 mikropipet lalu mencampurkannya dengan 50 mikroliter sampel DNA

8.      Mengambil sebanyak 25 mikroliter campuran sampel tersebutkemudian memasukan kedalam salah satu sumuran (1 kelompok mengisi 2 sumuran )

9.      Mengambil DNA leader sebanyak 6 mikroliter lalu memasukannya kedalam salah satu sumuran

10.  Menyalakan power suplay den menyeting pada voltase 70 – 75 volt

11.  Menghubungkan elektoforesis chamber dengan power supply, menunggu sampai 1 jam 30 menit atau sampai bercak berada di ujung agarose.

12.  Memasukan power supply dan mengambil tray yang berisi agarose.

13.  Memindahkan agorose ke dalam ethidium bromide dan merendamnya selama 30 menit.

14.  Setelah 30 menit mengambil agarose dan mencuci menggunakan aquades sebanyak 2 kali.

15.  Mengamati dengan menggunakan UV transluminator

F.     HASIL PENGAMATAN

G.    PEMBAHASAN

Pada praktikum ini dilakukan pemisahan terhadap molekul DNA dengan agarose dengan kosentrasi 1 %. Agarose dibuat dengan melarutkan 0,5 agarose dalam 50 ml TBE buffer. Kemudian dibuat medium sesuai dengan prosedur. Kepekatan medium tergantung pada besar kecilnya fragmen DNA yang akan dipisahkan. Semakin kecil kecil fragmen yang akan dipisahkan, kosentrasi agarose ditingkatkan sehingga agarose akan semakin padat. Chamber ektroforesis yang telah berisi TBE buffer, dimasukan medium yang diangkat tadi, dimana bagian sumur ditempatkan pada sisi kutub negative. Jika penempatan sumur terjadi secara berlawanan( posisi tida tepat ) maka tidak akan terdapat hasil. Prinsip kerjanya jika ada molekul yang bermuatan negative (DNA)  dilewatkan suatu medium, misalnya agarosekemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan (muatan positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negative ke kutub positif melalui membrane matriks gel agarose.

Elektroforesis menggunakan agarose merupakan jenis elektrofesis yang sederhana, cepat dan dapat memisahkan molekul yang diingikan dari matriks yang tidak dapat dilakukan oleh cara lain seperti sentrifugasi gradient.pada praktikum  Elektroforesis yang dilakukan menggunakan jenis  zona karena menggunakan gel agarose yang diletakan pada alat elektroforesis dan menggunakan Teknik horizontal.  Dalam hal ini, terdapat beberapa bahan seperti TBE buffer, loading buffer, DNA leader. TBE buffer berfungsi untuk meratakan medan listrik di dalam chamber elektroforsis menggunakan gel agarose. Gel ini berfungsi untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA sampel atau protein. Media yang sering digunakan dalam poses elektroforesis adalah agarose atau atau akrilamida. memisahkan molekul – molekul yang lebih besar. Namun pada praktikum ini menggunakan agarose karena  memiliki ukuran partikel yang lebih besar, sehingga daya pisah dari agarose lebih kasar dibandingkan dengan akrilamid. Penambahan loading buffer erfungsi sebagai pemberat bagi DNA yang sangat ringan sehingga DNA tidak meluber ke larutan TBE buffer dan bisa jatuh tepat di dalam sumuran. Loading buffer memiliki kekuatan sampai 5 kali dimana 1 μL loading buffer dapat digunakan sebagai pemberat untuk 4 μL sampel DNA. DNA leader adalaah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Sebelum disinari UV dilakukan perendaman agarose selama 30 menit pada laurtan ethidium bromide yang berfungsi untuk meningkatkan daya flouresensi DNA saat disinari UV.

       Dalam praktikum ini DNA yang di sinari UV berada di sumuran no 3 dan 5 dengan warna yang terbentuk merah oranye dan nampak lurus . Dari hasil pengamatan dengan hasil akhir stelah di sinari UV Nampak lurus dapat dikatakan tidak berhasil dalam percobaan kali ini. Jika percobaan ini berhasil DNA setelah disinari UV akan Nampak terputus – putus. Kegagalan ini dikarenakan beberapa diantaranya ketidak hati – hatian praktikan dalam melakukan percobaan atau laju dari pergerakan molekul DNA itu sendiri. Dalam proses elektroforesis factor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA ( wolfe. 1993 )

1.      Ukuran molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang dihadapi tidak banyak dibandingkan dengan molekul berukuran besar.

2.      Kosentrasi gel

Semakin tinggi kosentrasi agarose, semakin padat gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul – molekul DNA. Kosentrasi agarose yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, sedangkan kosentrasi agarose lebih rendah memudahkanpemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.      Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat

4.      Densintas mutan

Densitas mutan dalah mutan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muta tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan mutan yang rendah

5.      Pori – pori gel

Semakin kecil pori – pori gel yang digunakan semakin lambat pergerakan molekul DNA

6.      Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA

7.      Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA.

H.    KESIMPULAN.   

1.      Elektroforesis adalah suatu cara menganalisis kimiawi yang berdasarkan pada molekul – molekul protein bermuatan didalam medan listrik

2.      Prinsip pemisahan dengan elektroforesis gel ( agarose ) adalah pemisahan suatu molekul organic dari campurannya melalui suatu gel dalam suatu medan listrik.

3.      Kecepatan DNA dalam menembus agarose tergantung pada ukuran molekul DNA, kosentrasi gel agarose, penggunaan voltage, komposisi buffer elektoforesis, masa molekul DNA

4.      Perpendaraan  DNA dalam gel elektroforesis menggunakan sinar UV berwarna merah disebabkan oleh ethidium bromide dan adanya masa protein yang terbawa

5.      Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negative jika dialiri arus listrik akan bergerak menuju kutub positif milik melalui matriks membrane agarose .

I.       DAFTAR PUSTAKA

Biosciences, Amersham. 1999. Protein electrophoresis. USA : Amersham Biosciences

Makdeladin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis- Principles and Basics. Rijeka, Croatia : InTech Publisher

Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga

Martin, R . 1996. Gel Electrophoresis : Nucleid Acids. Oxford : Bros Scientific Publishers Ltd

J.      LAMPIRAN